Paul Thomas Pfluger

• Vitamin E ist der Überbegriff für 4 Tocopherole (α, β, γ und δ) sowie 4 Tocotrienole (α, β, γ und δ), die als gemeinsames Merkmal ein Chromanolringsystem sowie eine gesättigte (Tocopherole) bzw. ungesättigte (Tocotrienole) Seitenkette aufweisen. Neben ihrer antioxidativen Wirkung (Schutz von Membranen vor Lipidperoxidaton) konnten für einige Vitamin E - Formen auch eine Reihe von hochspezifischen, nicht-antioxidativen Wirkungen in vitro nachgewiesen werden. Meist bleibt jedoch unklar, ob ein solcher Effekt auch in vivo, also im Tiermodel oder direkt im Menschen, gefunden werden kann. In erster Linie müsste hierbei geklärt werden, ob die jeweilige Vitamin E - Form auch bioverfügbar, also in für eine Wirkung ausreichender Konzentration im Organismus vorhanden ist, oder aber vorher eliminiert und ausgeschieden wird. In dieser Doktorarbeit wurden deshalb wichtige Grundlagen zum Abbau der Tocopherole und Tocotrienole erarbeitet. • In HepG2-Zellen konnte der Abbau der Tocotrienole mit Hilfe flüssig- sowie gaschromatographischerVitamin E ist der Überbegriff für 4 Tocopherole (α, β, γ und δ) sowie 4 Tocotrienole (α, β, γ und δ), die als gemeinsames Merkmal ein Chromanolringsystem sowie eine gesättigte (Tocopherole) bzw. ungesättigte (Tocotrienole) Seitenkette aufweisen. Neben ihrer antioxidativen Wirkung (Schutz von Membranen vor Lipidperoxidaton) konnten für einige Vitamin E - Formen auch eine Reihe von hochspezifischen, nicht-antioxidativen Wirkungen in vitro nachgewiesen werden. Meist bleibt jedoch unklar, ob ein solcher Effekt auch in vivo, also im Tiermodel oder direkt im Menschen, gefunden werden kann. In erster Linie müsste hierbei geklärt werden, ob die jeweilige Vitamin E - Form auch bioverfügbar, also in für eine Wirkung ausreichender Konzentration im Organismus vorhanden ist, oder aber vorher eliminiert und ausgeschieden wird. In dieser Doktorarbeit wurden deshalb wichtige Grundlagen zum Abbau der Tocopherole und Tocotrienole erarbeitet. • In HepG2-Zellen konnte der Abbau der Tocotrienole mit Hilfe flüssig- sowie gaschromatographischer Analysemethoden vollständig aufgeklärt werden. Wie sich hierbei ergab, verläuft der Abbau weitgehend in Analogie zum Abbau der Tocopherole über eine durch Cytochrom P450 katalysierte initiale ω-Hydroxylierung mit 5 nachfolgenden β-Oxidationsschritten. • In vitro konnten in HepG2 – Zellen die Abbauraten der verschiedenen Vitamin E - Formen bestimmt werden. Dies nahmen in folgender Reihenfolge zu: α-Tocopherol < γ-Tocopherol < α-Tocotrienol < γ-Tocotrienol. • Wie sich mit Hilfe eines mit Cytochrom P450 hochangereicherten Homogenats aus Rattenlebern ergab, stellt die initiale ω-Hydroxylierung einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Abbaus dar: α-Tocopherol wurde weit langsamer hydroxyliert als alle anderen Vitamin E – Formen. • Der unterschiedliche Abbau von α-Tocopherol und γ-Tocotrienol konnte auch im Mäuseversuch in vivo bestätigt werden. Nach Fütterung von Mäusen mit α-Tocopherol wurden nur geringe Mengen von α-Tocopherolmetaboliten im Urin der Mäuse gefunden, während nach Applikation von γ-Tocotrienol hohe Konzentrationen der γ-Tocotrienolmetabolite nachgewiesen wurden. In Plasma und Leber wiederum wurden (dem Futtergehalt entsprechende) hohe α-Tocopherolkonzentrationen entdeckt, während γ-Tocotrienol selbst nach hoher Gabe nicht oder nur in Spuren nachweisbar war. In HepG2 – Zellen konnte gezeigt werden, dass γ-Tocotrienol eine cytotoxische Wirkung auf die Hepatocarcinoma-Zelllinie HepG2 entfalten kann, indem durch die Aktivierung der proteolytischen Caspase 3 die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) ausgelöst wird. Abschliessend lässt sich festhalten, dass der Körper lediglich das natürliche α-Tocopherol vor dem Abbau bewahrt, die anderen Vitamin E – Formen jedoch als Fremdstoffe behandelt und rapide ausscheidet. Als doppelter Schutz vor Verlust des “wertvollen” α-Tocopherol dienen hierbei das α-Tocopherol Transfer Protein sowie die in dieser Arbeit gefundenen Unterschiede im ersten Schritt des Abbaus, der Cytochrom P450 - katalysierten ω-Hydroxylierung. Beides erklärt die bevorzugte Retention von α-Tocopherol im Organsimus und seine hohe Bioaktivität. Will man deshalb in vitro Ergebnisse anderer Vitamin E – Formen auf die in vivo Situation übertragen, muss man die geringe Bioverfügbarkeit dieser Substanzen berücksichtigen.…
• The vitamin E family is comprised of 4 different tocopherols (Toc: α, β, γ, δ) and 4 different tocotrienols (T3: α, β, χ, δ). All share a hydroxychromanol ring and a saturated (Toc) or unsaturated (T3) side chain. Apart from their role as anti-oxidants (protection of membranes from lipid peroxidation), recent attention has focused on novel molecular, non-antioxidative functions. Numerous specific effects of tocopherols and tocotrienols were uncovered by a large variety of in vitro studies, in vivo - based evidence, however, is scarce. Moreover, little information exists on the bioavailabilty of the different vitamin E - forms. To better understand the biological role of the different tocopherols and tocotrienols, this thesis therefore aimed to address the basic but important aspect of tocopherol and tocotrienol metabolism. • In HepG2 cells, the metabolic pathway of α- and γ-T3 could be elucidated by the identification of all intermediary degradation products by using high performance liquid- as well as gas-chromatography. Thus,The vitamin E family is comprised of 4 different tocopherols (Toc: α, β, γ, δ) and 4 different tocotrienols (T3: α, β, χ, δ). All share a hydroxychromanol ring and a saturated (Toc) or unsaturated (T3) side chain. Apart from their role as anti-oxidants (protection of membranes from lipid peroxidation), recent attention has focused on novel molecular, non-antioxidative functions. Numerous specific effects of tocopherols and tocotrienols were uncovered by a large variety of in vitro studies, in vivo - based evidence, however, is scarce. Moreover, little information exists on the bioavailabilty of the different vitamin E - forms. To better understand the biological role of the different tocopherols and tocotrienols, this thesis therefore aimed to address the basic but important aspect of tocopherol and tocotrienol metabolism. • In HepG2 cells, the metabolic pathway of α- and γ-T3 could be elucidated by the identification of all intermediary degradation products by using high performance liquid- as well as gas-chromatography. Thus, tocotrienols are degraded in analogy to tocopherols with an initial ω-hydroxylation and 5 subsequent β-oxidation steps. • In vitro (HepG2 cells), tocotrienols were degraded to a larger extent than tocopherols, and γ-Toc to a larger extent than α-Toc. Differences reached two orders of magnitude with α-Toc < γ-Toc < α-T3 < γ-T3. • By using rat liver microsomes that were highly enriched with cytochrome P450 enzymes, the initial ω-hydroxylation was shown to be a rate limiting step in the degradation of vitamin E: α-Toc is hydrolysed to a much smaller extent than all other vitamin E forms. • The differences in vitamin E metabolism were confirmed in vivo using male mice. After supplementation with α-Toc, only little amounts of α-Toc metabolites were found in urine, while oral administration of γ-T3 led to the rapid excretion of large amounts of γ-T3 metabolites. Correspondingly, in plasma and liver α-Toc levels were high but γ-T3 could hardly be detected. • γ-T3 but no other vitamin E – form was shown to be highly cytotoxic for HepG2 cells. Immunohistochemistry stainings revealed that γ-T3 induced apoptosis by activation of the proteolytic caspase 3. To summarize, α-Toc is metabolized to a much smaller extent than all other vitamin E - forms. Both the α-tocopherol transfer protein as well as the here described differences in the ω-hydroxylation rates provide a double protection for the “valuable” α-Toc from degradation. Both phenomena explain the high retention of α-Toc in the organism and its higher bioactivity, compared to other Vitamin E forms. The differences in the metabolism of vitamin E might therefore lead to an inequivalence of biological activities found in vitro vs. in vivo.…