Andreas Lietz

• Apoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. DieApoptose, der programmierte Zelltod, spielt eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht zwischen Proliferation und Sterben von Zellen und ist außerdem an der Beseitigung von infizierten und geschädigten Zellen beteiligt. Apoptose kann durch Stimulation von Rezeptoren aus der Familie der TNF-Rezeptoren wie CD95, ausgelöst werden. Nach Liganden-induzierter Trimerisierung der Rezeptoren bindet FADD an den zytoplasmatischen Teil des Rezeptors und rekrutiert Caspase-8 und/oder -10. Die räumliche Nähe der Caspasen in diesem als DISC bezeichneten Komplex führt zu ihrer auto- und transkatalytischen Spaltung und damit Aktivierung. Dadurch wird das apoptotische Programm gestartet, welches zum Tod der Zelle führt. Kontrolliert wird dieser Vorgang von einer Vielzahl anti-apoptotischer Proteine. Störungen in diesem System sind an der Entstehung einer Reihe von Krankheiten beteiligt. Die Blockade der Apoptoseinduktion kann zur Entstehung von Tumoren beitragen. Das klassische Hodgkin Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Systems. Die Tumorzellen sind große, einkernige Hodgkin- oder mehrkernige Reed/Sternbergzellen (HRS-Zellen). Sie leiten sich von Keimzentrum-B-Zellen ab. In HRS-Zellen fehlt die Expression einer Vielzahl von typischen B-Zellmarkern, darunter die des B-Zellrezeptors. Solche B-Zellen sterben normalerweise während der Keimzentrumsreaktion durch Apoptose. An diesem Prozess ist CD95 beteiligt. In einer Reihe von malignen Erkrankungen wurden eine Herunterregulation der CD95-Expression oder Mutationen im CD95-Gen beobachtet. Es wird daher vermutet, dass CD95-induzierte Apoptose zur Entfernung von Tumorzellen beiträgt. Im Gegensatz dazu exprimieren sowohl primäre HRS-Zellen als auch etablierte HRS-Zelllinien in der Regel Wildtyp-CD95, sind aber trotzdem CD95-resistent. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Komponenten des CD95-Systems, im Gegensatz zu anderen malignen Erkrankungen, in den HRS-Zellen hochreguliert sind, darunter CD95 selbst. In immunpräzipitierten DISCs von CD95-stimulierten HRS-Zellen wurde neben FADD und Caspase-8/-10 auch c-FLIP nachgewiesen. c-FLIP ist ein Caspase-8/-10-Homolog, das ebenfalls an FADD bindet, aber aufgrund fehlender katalytischer Aktivität die Aktivierung der Caspasen im DISC und damit die Apoptoseinduktion verhindert. Eine starke c-FLIP-Expression konnte in allen HRS-Zelllinien und in den HRS-Zellen nahezu aller untersuchter primärer Hodgkinfälle (55/59) gezeigt werden. Durch siRNA-vermittelte Herunterregulation von c-FLIP war es möglich, HRS-Zelllinien gegenüber CD95-induzierter Apoptose zu sensitivieren. Dies zeigt, dass die CD95-Rezeptor-induzierte Apoptose in den HRS-Zellen nicht strukturell, sondern funktionell inhibiert ist und c-FLIP stark zu dieser Inhibition beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die c-FLIP-Expression in den HRS-Zellen von der konstitutiven Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB abhängt, die charakteristisch für diese Zellen ist. Normalerweise wird NF-κB von Inhibitorproteinen, den IκBs, im Zytoplasma zurückgehalten. Diverse Stimuli können den IKK-Komplex aktivieren, der die IκBs an bestimmten Serinresten phosphoryliert. Dies hat die Ubiquitinylierung und den Abbau der IκBs zur Folge, wodurch NF-κB frei wird, in den Kern wandert und dort seine Zielgene aktiviert. Es wird angenommen, dass in HRS-Zellen ein konstitutiv aktiver IKK-Komplex und teilweise Mutationen der IκB-Proteine zur konstitutiven NF-κB-Aktivität beitragen. Zu den NF-κB-abhängigen Genen in den HRS-Zellen gehören solche mit anti-apoptotischer und Zellzyklus-treibender Wirkung. Die Inhibition der NF-κB-Aktivität in den HRS-Zellen führt zu Apoptose und eingeschränkter Proliferation. Von dreiwertigem Arsen ist bekannt, dass es die Induzierbarkeit des IKK-Komplexes inhibieren kann und damit letztendlich die Aktivierung von NF-κB. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Arsen in HRS-Zellen den konstitutiv aktiven IKK-Komplex inhibiert. In Zelllinien mit intakten IκB-Proteinen führte dies zur NF-κB-Inhibition und Apoptoseinduktion. Die Reduktion der NF-κB-Aktivität ging mit der Herunterregulation von anti-apoptotischen und Proliferations-fördernden Zielgenen einher. Die ektope Überexpression von NF-κB hob die Apoptose-induzierende Wirkung von Arsen teilweise auf. Durch Arsen-Behandlung von Mäusen konnte das Tumorwachstum xenotransplantierter HRS-Zellen stark verlangsamt werden. In explantierten Tumorzellen konnte ebenfalls eine NF-κB-Inhibition nachgewiesen werden. Die NF-κB-Inhibition durch Arsen trägt also stark zur Apoptoseinduktion in den HRS-Zellen bei. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Modulation der Apoptoseresistenz neue therapeutische Ansätze für die Behandlung des Hodgkin Lymphoms bieten könnte. Der Einsatz von Arsen ist dabei besonders interessant, da Arsen schon für die Behandlung anderer maligner Erkrankungen eingesetzt wird.…
• Apoptosis, the programmed cell death, is important for the balance between proliferation and dying of cells. It is also involved in the removal of infected and damaged cells. Apoptosis can be induced by stimulation of receptors of the TNF-receptor family like CD95. After ligand-induced trimerisation of these receptors, FADD binds to the cytoplasmic part of the receptor and recruits Caspase-8 and/or -10. The induced proximity of the caspases in this complex, called DISC, leads to their auto- and transcatalytic cleavage and subsequently to their activation. This starts the apoptotic program which leads to the death of the cell. A number of anti-apoptotic proteins control this process. The deregulation of this system is involved in a variety of diseases. The disruption of the apoptotic program can contribute to the development of tumors. Classical Hodgkin Lymphoma is a malignant disease of the lymphatic system, characterized by mononucleated Hodgkin or multinucleated Reed/Sternberg (HRS) cells. These tumor cells are derived fromApoptosis, the programmed cell death, is important for the balance between proliferation and dying of cells. It is also involved in the removal of infected and damaged cells. Apoptosis can be induced by stimulation of receptors of the TNF-receptor family like CD95. After ligand-induced trimerisation of these receptors, FADD binds to the cytoplasmic part of the receptor and recruits Caspase-8 and/or -10. The induced proximity of the caspases in this complex, called DISC, leads to their auto- and transcatalytic cleavage and subsequently to their activation. This starts the apoptotic program which leads to the death of the cell. A number of anti-apoptotic proteins control this process. The deregulation of this system is involved in a variety of diseases. The disruption of the apoptotic program can contribute to the development of tumors. Classical Hodgkin Lymphoma is a malignant disease of the lymphatic system, characterized by mononucleated Hodgkin or multinucleated Reed/Sternberg (HRS) cells. These tumor cells are derived from germinal-center B-cells. However, HRS cells lack the expression of typical B cell markers, such as the B-cell receptor. Usually, B-cells without B-cell receptor expression die by apoptosis during the germinal-center reaction. CD95 is involved in this process. It has been shown previously that in many malignant diseases CD95 is down-regulated or mutated, indicating that CD95 is involved in the removal of tumor cells. In opposite to these findings, primary HRS cells and Hodgkin-derived cell lines usually express wild type CD95, but are resistant to CD95 induced apoptosis. In this work, it could be demonstrated that in contrast to other malignant diseases components of the CD95 system are up-regulated in HRS cells, including CD95 itself. By immunoprecipitation it was shown that, in addition to FADD and Caspase-8/-10, c-FLIP is a component of the DISC in CD95-stimulated cells. c-FLIP is a caspase homolog which, like caspases, binds to FADD, but lacks proteolytic activity. It inhibits the activation of caspases in the DISC and thus prevents apoptosis induction. A strong c-FLIP expression was shown in all HRS cell lines and in HRS cells of nearly all investigated primary cases of Hodgkin Lymphoma (55/59). siRNA-mediated (small interfering RNA) down-regulation of c-FLIP sensitized HRS cell lines to CD95-induced apoptosis. This shows that the CD95 receptor-induced apoptosis in HRS cells is not structurally but functionally inhibited and that c-FLIP strongly contributes to this inhibition. In addition, it was shown that c-FLIP expression depends on the constitutive activity of the transcription factor NF-κB which is characteristic for HRS cells. Usually, NF-κB is sequestered in the cytoplasm by inhibitor proteins, the IκBs. A variety of stimuli can activate the IKK-complex which subsequently phosphorylates the IκBs, leading to their ubiquitinylation and degradation. The released NF-κB translocates to the nucleus where it activates the transcription of target genes. It is supposed that a constitutively activated IKK complex and, in some cases, mutated IκB proteins contribute to the constitutive NF-κB activity in HRS cells. To the NF-κB dependent genes in HRS cells belong those with anti-apoptotic and cell cycle promoting activities. Inhibition of the NF-κB activity in HRS cells leads to apoptosis and decreased proliferation. Trivalent arsenic is known to inhibit the induction of the IKK complex and thus the activation of NF-κB. In this work, it was shown that arsenic inhibits the constitutively active IKK complex in HRS cells. This led to an inhibition of NF-κB and induction of apoptosis in HRS cell lines with non-mutated IκB proteins. The NF-κB inhibition was accompanied by the down-regulation of anti-apoptotic and cell cycle promoting genes. Ectopic overexpression of NF-κB partially reverted the apoptotic effect of arsenic. Treatment of mice with arsenic reduced the growth of subcutaneously xenotransplanted HRS cells. In explanted tumor cells, a reduced NF-κB activity could be demonstrated following treatment with arsenic. Thus, the inhibition of NF-κB by arsenic contributes to the induction of apoptosis in HRS cells. Taken together, the results indicate that modulation of the apoptosis resistance may offer new strategies for the treatment of Hodgkin Lymphoma. Of particular interest is the application of arsenic because it is already used in the treatment of other malignant disorders.…