Charakterisierung von Sulfotransferasen im Gastrointestinaltrakt von Mensch und Ratte und Aktivierung von Promutagenen in V79-Zellen, die eine intestinale Form (1B1) des Menschen und der Ratte exprimieren

  • Die Ausstattung der gastrointestinalen Mukosa des Menschen und der Ratte mit Sulfotransferasen wurde mit Hilfe von Immunodetektion und Enzymaktivitätsmessungen untersucht. In Proben aus Colon und Rektum von 39 Personen wurden die Formen h1A1, h1A3 und h1B1 identifiziert, wobei in einer weiteren Probe, die als einzige von einem an Colitis Ulcerosa erkrankten Patienten stammte, keine Sulfotransferasen nachgewiesen werden konnten. Bei der Immunblot-Analyse war das Expressionsmuster der einzelnen Formen in allen Proben ähnlich. In wenigen Proben waren die relativen Signalintensitäten der h1A1 und der h1B1 um die Hälfte erniedrigt. Der Gehalt von SULT an zytosolischem Protein zeigte einen bis zu 8 - 10fachen Unterschied, er betrug jedoch bei zwei Dritteln der Proben zwischen 0,15 und 0,3 (h1A1 und h1A3) bzw. 0,6 und 0,8 Promille (h1B1). Die Variation konnte nicht auf Alter, Geschlecht oder Krankheitsbild der Patienten zurückgeführt werden. Auch der für die allelischen Varianten der h1A1 beschriebene Effekt auf die Enzymaktiviät bzw.Die Ausstattung der gastrointestinalen Mukosa des Menschen und der Ratte mit Sulfotransferasen wurde mit Hilfe von Immunodetektion und Enzymaktivitätsmessungen untersucht. In Proben aus Colon und Rektum von 39 Personen wurden die Formen h1A1, h1A3 und h1B1 identifiziert, wobei in einer weiteren Probe, die als einzige von einem an Colitis Ulcerosa erkrankten Patienten stammte, keine Sulfotransferasen nachgewiesen werden konnten. Bei der Immunblot-Analyse war das Expressionsmuster der einzelnen Formen in allen Proben ähnlich. In wenigen Proben waren die relativen Signalintensitäten der h1A1 und der h1B1 um die Hälfte erniedrigt. Der Gehalt von SULT an zytosolischem Protein zeigte einen bis zu 8 - 10fachen Unterschied, er betrug jedoch bei zwei Dritteln der Proben zwischen 0,15 und 0,3 (h1A1 und h1A3) bzw. 0,6 und 0,8 Promille (h1B1). Die Variation konnte nicht auf Alter, Geschlecht oder Krankheitsbild der Patienten zurückgeführt werden. Auch der für die allelischen Varianten der h1A1 beschriebene Effekt auf die Enzymaktiviät bzw. Stabilität konnte in der Menge an immunreaktivem Protein nicht in diesem Ausmaß detektiert werden. Die Allelhäufigkeit von h1A1*R und h1A1*H war gegenüber der gesunden Bevölkerung nicht verändert. In den sieben Proben aus dem Dünndarm (Coecum, viermal Ileum, Jejunum) konnten zusätzlich die Formen h1E1 und h2A1 identifiziert werden. Ein möglicherweise der Form h1C1 entsprechendes Protein wurde im Magen detektiert. Im Vergleich zum Menschen war die Expression in der Ratte stärker auf die Leber konzentriert. Während beim Menschen in allen untersuchten Abschnitten Sulfotransferasen in Mengen detektiert wurden, die in zwei Fällen (h1B1 und h1A3) sogar den Gehalt in der Leber überstiegen, beschränkte sich die Expression in der Ratte auf im Vergleich zur Leber geringe Mengen im Magen und Dickdarm. Nachgewiesen wurden die r1B1, r1A1 sowie eine nicht identifizierte Form von 35kD, bei der es sich vermutlich um die r1C2 handelt. Im Vergleich zur Leber enthielt der Dickdarm der Ratte 20 - 30 % an r1B1 und 3 % an r1A1, während im Dickdarm des Menschen die 3 - 5fache Menge an h1B1 und 25 - 50 % an h1A1 gefunden wurden. Die nicht identifizierte Form verhielt sich wie die r1B1. Die für die Leber der Ratte bekannte geschlechtsabhängige Expression wurde im Gastrointestinaltrakt nicht beobachtet. Die Verteilung der Sulfotransferasen im Colon und Ileum des Menschen wurde immunhistochemisch untersucht; für die Gewebe der Ratte war die Spezifität der zur Verfügung stehenden Antiseren nicht ausreichend. Im Colon traten h1B1-spezifische Färbungen in den differenzierten Enterozyten am oberen Ende der Krypten auf, im Dünndarm wurden die Epithelzellen der Zotten gefärbt. Die Färbung konzentrierte sich auf das Zytoplasma. Eine ähnliche Verteilung zeigte sich für h1A1 und h1A3, außer daß zusätzlich eine intensive Färbung der Endothelzellen der Kapillaren in der Submukosa des Ileums auftrat. Im Dickdarm war dies nur bei den Kapillaren in den Lymphfollikeln zu erkennen. Die h2A1 war lediglich im Zytoplasma der Epithelzellen der Zotten des Ileums nachzuweisen, während im Colon keine Farbreaktion auftrat. Durch die Verwendung der rekombinanten Indikatorstämme TA1538-h1A1, -h1A3 und -h1B1 und des Ausgangsstammes Salmonella typhimurium TA1538 im Ames-Test wurde gezeigt, daß verschiedene benzylische und allylische Alkohole durch im humanen Colon exprimierte Sulfotransferasen zu Mutagenen aktiviert werden. In den meisten Fällen erwies sich eine der drei Sulfotransferasen als besonders effizient in der Bioaktivierung, während durch die anderen Formen kein oder nur ein schwacher Effekt verursacht wurde. Die Bioaktivierung von Promutagenen durch Sulfotransferasen im Colon muß im Zusammenhang mit der Lokalisation diskutiert werden. Die Zellen im Darm, in denen immunhistochemisch Sulfotransferasen detektiert wurden, haben mit Ausnahme des Endothels je nach Abschnitt eine Lebensdauer von maximal fünf Tagen und machen keine weiteren Zellteilungen mehr durch. Daher sind DNA-Schäden in diesen Zellen ein sehr geringes Risiko für den Organismus. Soweit die reaktiven Metabolite in diesen Zellen gefangen bleiben, kann die Bioaktivierung in diesen Zellen und die Bildung von Addukten als protektiv betrachten werden, da letztere nach wenigen Tagen mit den toten Zellen in das Darmlumen abgegeben werden. Für den Vergleich der Bioaktiverung von Promutagenen durch die Form 1B1 des Menschen und der Ratte wurden aus V79 Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters abgeleitete Zellinien hergestellt, die je eine der beiden Formen stabil exprimieren. Damit standen 1B1-profiziente Indikatorzellen für den HPRT-Genmutationstest zur Verfügung, und die 1B1-abhängige Bioaktivierung konnte in einem System untersucht werden, die dem eukaryontischen Organismus näher steht als die für die Ames-Tests verwendeten Bakterien. So war z.B. die Sulfotransferase wie im Gewebe im Zytoplasma lokalisiert. Als Modellsubstanzen wurden hierbei die bereits in TA1538-h1B1 mutagen wirkenden benzylischen Alkohole 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren und 4-Hydroxycyclopenta-[def]chrysen getestet. Da die Sensitivität einer Sulfotransferase-exprimierenden V79-Zellinie sowohl durch die Menge an Sulfotransferase als auch durch die Verfügbarkeit des Sulfodonors limitiert sein könnte, wurden die Mutagenitätsexperimente mit V79-r1B1-Zellinien durchgeführt, die sich in ihrer Enzymaktivität um das Zwanzigfache unterschieden: V79-r1B1/A und -/B. Eine starke Erhöhung der Mutantenfrequenz wurde nur in der hoch exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A (1019 ± 224 pmol/mg/min) beobachtet, so daß eine gravierende Beeinträchtigung der Sensitivität durch einen Mangel an Kosubstrat ausgeschlossen wurde. In der niedriger exprimierenden Zellinie V79-r1B1/B (57 ± 9 pmol/mg/min) war nur mit 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyren ein schwacher Anstieg der Mutantenfrequenz zu erkennen, der mit 0,3 µM bei einer in etwa 100fach höheren Konzentration begann als bei V79-r1B1/A. Die zytosolische Fraktion aus V79-r1B1/B-Zellen enthielt in etwa die dreifache Menge an r1B1-Protein wie die aus Colonmucosa der Ratte. Da zumindest für die humane Mukosa gezeigt wurde, daß die 1B1 nur im einschichtigen Epithel, nicht aber in allen Zellen der Mukosa exprimiert wird, repräsentiert die zytosolische Fraktion aus der Mukosa nur bedingt die Expression in den Epithelzellen und der Vergleich mit den V79-1B1-Zellen ist grob. Im Gegensatz zu V79-r1B1/B war die Zellinie V79-h1B1, die ebenfalls nur mit Darm und Leber vergleichbare Mengen an h1B1 exprimierte, in der Lage, beide benzylischen Alkohole zu aktivieren. Der Erhöhung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur KontrollZellinie war ähnlich wie bei der stark exprimierenden Zellinie V79-r1B1/A, erforderte aber 10fach höhere Konzentrationen. Somit unterscheiden sich Mensch und Ratte nicht nur insgesamt in ihrer Ausstattung des Gastrointestinaltrakts mit Sulfotransferasen, auch bei Betrachtung einer einzelnen Form zeigten sich deutliche Unterschiede in der Aktivierung von zwei Promutagenen. Die Ratte ist daher ein ungeeignetes Modell, um die Rolle von Sulfotransferasen bei tumorinitiierenden Prozessen im Darm zu untersuchen. Dies unterstreicht die Bedeutung von rekombinanten in-vitro-Systemen für die Erfassung des humanen Metabolismus von Fremdstoffen. Insgesamt kennt man nur eine geringe Anzahl von Substanzen, die im Tierexperiment Colontumore erzeugen, und mit Ausnahme der heterozyklischen aromatischen Amine sind diese lediglich von experimenteller Bedeutung. Dies spricht für effiziente Schutzmechanismen der Darmmukosa gegenüber Mutagenen und läßt die Frage nach der hohen Inzidenz des Kolorektalkarzinoms offen.show moreshow less
  • Cytosolic fractions of human and rat gastro-intestinal mucosa were electrophoresed, blotted and probed with six antibodies with differing specificities for sulfotransferase (SULT) forms. Using SULTs heterologously expressed in bacteria for comparison of electrophoretic and immunoreactive properties the following SULTs could be identified in the different parts of the human (h) gastro-intestinal tract: h1A1, h1A3 and h1B1 were detected in all parts analyzed (rectum, colon, caecum, ileum, jejunum, stomach), h1E1 and h2A1 only in the small intestine and h1C1 only in stomach. The presence of h2A1 and h1E1 in the small intestine was also confirmed by enzyme activity measurements using radiolabelled dehydroepiandrosterone and b-estradiol as substrates. SULTs were detected in almost all of the samples analyzed (rectum: 8 of 8, colon: 22 of 23, ileum 5 of 5 and one each of coecum, jejunum and stomach). The colon sample void of SULT protein was the only one taken from a patient suffering from ulcerative colitis. Using an antibody whichCytosolic fractions of human and rat gastro-intestinal mucosa were electrophoresed, blotted and probed with six antibodies with differing specificities for sulfotransferase (SULT) forms. Using SULTs heterologously expressed in bacteria for comparison of electrophoretic and immunoreactive properties the following SULTs could be identified in the different parts of the human (h) gastro-intestinal tract: h1A1, h1A3 and h1B1 were detected in all parts analyzed (rectum, colon, caecum, ileum, jejunum, stomach), h1E1 and h2A1 only in the small intestine and h1C1 only in stomach. The presence of h2A1 and h1E1 in the small intestine was also confirmed by enzyme activity measurements using radiolabelled dehydroepiandrosterone and b-estradiol as substrates. SULTs were detected in almost all of the samples analyzed (rectum: 8 of 8, colon: 22 of 23, ileum 5 of 5 and one each of coecum, jejunum and stomach). The colon sample void of SULT protein was the only one taken from a patient suffering from ulcerative colitis. Using an antibody which crossreacts with all human SULT1 forms, a similar pattern of immunoreactivity was observed for all positive samples of rectum and colon mucosa. However, the total amount of immunoreactive protein varied 8 - 10 fold. SULT content in two thirds of the samples was between 0.15 and 0.3 ‰ (h1A1 and h1A3) and 0.6 and 0.8 ‰ (h1B1). This variation could neither be related to age, gender nor disease. The distribution of the allelic variants h1A1*Arg and h1A1*His was analyzed by restriction fragment length polymorphism and the allele frequency in patients suffering from colorectal carcinoma (n = 39) was found not to differ from the values published for normal population. The reduced enzyme activity and stability that has been described for h1A 1*His in platelats was not reflected in the amount of h1A1 protein in the samples of colon and rectum mucosa. Expression of h1A1 and h1A3 was approximately four times higher in ileum than in colon, whereas amounts of h1B1 were comparable in both parts of the intestine. Some of these forms were also expressed at similar, or higher levels in the liver. However, the level of h1B1 protein was higher in the gut than in the liver, and h1A3 was hardly expressed in liver. In rat (r), unlike human, SULTs were poorly expressed in the intestine. r1B1 and an unidentified immunoreactive protein of 35kD were found in the large intestine (rectum, colon, coecum), the proximal jejunum and glandular stomach. r1A1 protein was detected in the large intestine and forestomach. However, the highest levels of these forms in the intestine reached only 3% (r1A1) and 20% (r1B1 and 35kD-protein) of those detected in liver. Unlike in liver, SULT expression in the intestine was independent on gender. Immunohistochemical analysis of human colon and ileum using antibodies specific for either h1B1, h2A1 or all forms of h1A showed that all forms were expressed in the cytosol of the short-lived absorptive cells. In ileum, expression was restricted to villus cells with no staining of crypt cells; except for h1A forms, which were also detected in the endothelial cells of capillaries in the submucosa. In colon, h1B1 and h1A forms, but not h2A1 were detected in the upper third of the crypts. Sensitivities of the antibodies were insufficient for analysis of rat intestine. As 1B1 was the most prominent form in the intestine of both species, Ames tests and hprt gene mutation assays were performed using indicator cells constructed for heterologous expression of 1B1. 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyrene and 4-hydroxycyclo-penta[def]chrysene were detected as strong mutagens in Salmonella typhimurium TA1538-h1B1 but neither in the SULT-deficient parental strain nor in bacteria expressing h1A1 or h1A3. Other benzylic or allylic alcohols were mutagenic in Salmonella typhimurium TA1538-h1A1 or h1A3, but not in the h1B1-expressing strain. For the mammalian system, one cell line with high 1B1 activity as determined by turnover of a-naphthol at 1µM and two cell lines with lower activity were established: V79-r1B1/A (1019 ± 224 pmol/mg/min), V79-r1B1/B (57 ± 9 pmol/mg/min) and V79-h1B1 (19 ± 5 pmol/mg/min). 1B1 expression in cytosolic fractions was comparable to rat liver and human colon for V79-r1B1/B and V79-h1B1 respectively. Subcellular distribution was analyzed by immunostaining of cultured cells fixed with methanol. Strong staining of the cytosol was observed in most, but not all of the V79-r1B1/A cells. No staining was observed in V79-r1B1/B, V79-h1B1 or the parental V79 cells. In all cell lines, expression was stable over at least 25 passages and could be detected after 24, 48 and 72 h of cultivation. Population doubling times were 13,1 ± 0.6 h for V79-h1B1 (n = 4), 14.1 ± 1.3 h for V79-r1B1/A (n = 6) and 14.1 ± 1.7 h (n = 3) for V79-r1B1/B. 6-Hydroxymethylbenzo[a]pyrene and 4-hydroxycyclopenta[def]chrysene were detected as strong mutagens in V79-1B1 cells, but not in SULT-deficient control cells. The effect was strong in V79-r1B1/A and V79-h1B1, but weak and occurring at higher concentrations in V79-r1B1/B. Comparing immunoreactivity in cytosolic fractions and fixed cells, h1B1 was expressed more strongly in colonic epithelial cells than in V79-h1B1. It is therefore probable that the compounds tested are also activated in the human gut; however, due to the cellular localization of the enzyme, differentiated cells may be affected primarily. Since these cells are discarded into the gut lumen after a few days and do not undergo further cell divisions, the risk of causing mutations should be low. This mechanism may lead to a presystemic elimination of dangerous compounds. For the study of SULT1B1 mediated mutagenicity in human intestine, rat is a poor model since rat 1B1 was much less capable of activating the benzylic alcohols and was also found to be present in this organ in lower amounts than the human form.show moreshow less

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Metadaten
Author details:Wera Teubner
URN:urn:nbn:de:kobv:517-0000084
Supervisor(s):Pablo Steinberg, Michael Arand, Hans-Rudolf Glatt
Publication type:Doctoral Thesis
Language:German
Publication year:2001
Publishing institution:Universität Potsdam
Granting institution:Universität Potsdam
Date of final exam:2001/05/18
Release date:2005/02/07
RVK - Regensburg classification:WD 5848
Organizational units:Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät / Institut für Ernährungswissenschaft
DDC classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
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