Ulrike Pabel

• Aromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurdenAromatische Amine und Amide (aAA) sind aufgrund ihrer starken Verbreitung in der menschlichen Umwelt und ihres kanzerogenen Potenzials von großer toxikologischer Bedeutung. Die Kanzerogenität der aAA wird durch die Mutagenität hochreaktiver Stoffwechselprodukte vermittelt, die in zwei sequenziellen katalytischen Reaktionen entstehen. Die erste ist meistens eine N-Hydroxylierung, die oft durch Cytochrom P450 1A2 (CYP1A2) katalysiert wird. Daran schließt sich eine O-Konjugation durch Sulfotransferasen (SULT) oder N-Acetyltransferasen (NAT) an. Die Bioaktivierung ist ein kritischer Parameter für die Übertragbarkeit von Ergebnissen aus Tiermodellen auf den Menschen. Rekombinante in vitro Systeme, die fremdstoffmetabolisierende Enzyme verschiedener Spezies exprimieren, ermöglichen die vergleichende Untersuchung der Bioaktivierung im Menschen und in Versuchstieren. Ziel des Projektes war die Aufklärung der Bioaktivierung der aAA durch humane Enzyme. Im Vordergrund stand die Untersuchung der Rolle humaner SULT in diesem Prozess. Es wurden rekombinante in vitro Systeme, konstruiert, die CYP1A2 und SULT des Menschen koexprimieren. SULT-cDNAs wurden in den Säugerzell Expressionsvektor pMPSV kloniert und in Standardindikatorzellen für Mutagenitätsuntersuchungen (V79 Zellen aus dem Chinesischen Hamster) transfiziert. Das Expressionsniveau von CYP1A2 und SULT wurde mittels Immunblotanalyse und radiometrischen Aktivitätsmessungen charakterisiert. In den rekombinanten Zellen wurden vier aAA als Modellsubstanzen (2-Acetylaminofluoren, 2-Aminoanthracen, 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol, 2,4-Diaminotoluol) auf ihre Mutagenität am hprt-Locus hin untersucht.Die aAA waren in Zellen, die keine rekombinanten Enzyme oder lediglich CYP1A2 exprimierten, nicht mutagen. In Zellen, die CYP1A2 und SULT der Subfamilie 1A koexprimierten, erzeugten sie bereits in geringen Konzentrationen klare mutagene Effekte (0,3 µM für 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol; 0,1 µM für 2-Aminoanthracen; 10 µM für 2,4-Diaminotoluol). Die stärkste Aktivierung von 2-Acetylaminofluoren und 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A2 koexprimierte; die stärkste Aktivierung von 2,4-Diaminotoluol und 2-Aminoanthracen erfolgte in der Zelllinie, die CYP1A2 und SULT1A1 koexprimierte. Sowohl SULT1A1 als auch SULT1A2 sind im Menschen genetisch polymorph. Ein unterschiedlich starkes Aktivierungspotenzial der Alloenzyme könnte eine individuell unterschiedliche Suszeptibilität für die durch aAA ausgelöste Kanzerogenese bedingen. In HPRT-Mutationsuntersuchungen mit rekombinanten Zellen zeigten die allelischen Varianten der SULT1A2 starke Unterschiede in ihrem Aktivierungpotenzial. Nur in der Zelllinie, die das Alloenzym SULT1A2*1 mit CYP1A2 koexprimierte, wurde 2-Acetylaminofluoren zum Mutagen aktiviert. Zur Aktivierung von 3′-Methyl-4-dimethylaminoazobenzol waren jedoch sowohl das Alloenzym SULT1A2*1 als auch das Alloenzym SULT1A2*2 in der Lage. Die Alloenzyme der SULT1A1 zeigten ein ähnlich gutes Aktivierungspotenzial für aAA. In früheren Studien wurde gezeigt, dass die SULT1C1 der Ratte eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der aAA in dieser Spezies spielt. Dahingegen war die humane SULT1C1 nicht in der Lage die untersuchten aAA zu aktivieren. Die Kenntnis solcher Spezieunterschiede könnte wichtig sein um unterschiedliche Organotropismen aAA in Menschen und Tiermodellen zu erklären, da SULT mit starker Gewebespezifität exprimiert werden und das Expressionsmuster für die einzelnen SULT-Formen in Menschen und Ratten sich stark unterscheidet.…
• Aromatic amines and amides (aAA) represent a group of chemicals with great toxicological importance due to their wide distribution in the environment and their carcinogenic potency. The carcinogenicity of aAA is mediated by the mutagenic action of highly reactive metabolites. They are frequently formed by N-hydroxylation of the exocyclic amino group, usually catalysed by cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) and subsequent O-conjugation by phase-II enzymes e.g. sulfotransferases (SULT) or N-acetyltransferases. The bioactivation constitutes a critical parameter for the transfer of results from animal models on man. Recombinant in vitro systems expressing xenobiotic metabolizing enzymes of different species allow the comparative study of the bioactivation in humans and animal models. <BR>The aim of this project was to elucidate the bioactivation of aAA by human xenobiotic enzymes. The investigation focused on the role of SULT in this process. SULT-cDNAs were cloned into the mammalian expression vector pMPSV and transfected in V79 ChineseAromatic amines and amides (aAA) represent a group of chemicals with great toxicological importance due to their wide distribution in the environment and their carcinogenic potency. The carcinogenicity of aAA is mediated by the mutagenic action of highly reactive metabolites. They are frequently formed by N-hydroxylation of the exocyclic amino group, usually catalysed by cytochrome P450 1A2 (CYP1A2) and subsequent O-conjugation by phase-II enzymes e.g. sulfotransferases (SULT) or N-acetyltransferases. The bioactivation constitutes a critical parameter for the transfer of results from animal models on man. Recombinant in vitro systems expressing xenobiotic metabolizing enzymes of different species allow the comparative study of the bioactivation in humans and animal models. <BR>The aim of this project was to elucidate the bioactivation of aAA by human xenobiotic enzymes. The investigation focused on the role of SULT in this process. SULT-cDNAs were cloned into the mammalian expression vector pMPSV and transfected in V79 Chinese Hamster cells, which represent standard indicator cells for mutagenicity tests. Selected SULT-cDNAs were also co-expressed with human CYP1A2. These cells were able to catalyse internally both enzymatic reactions that are necessary for the bioactivation of aAA. The expression level of CYP1A2 and SULT in the co-expressing cell clones was characterised by immunoblot analysis and radiometric SULT-activity measurement. The mutagenicity of four aAA model compounds, 2-aminoanthracene, 2-acetylaminofluorene, 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene and 2,4-diaminotoluene, at the hprt locus of the recombinant cell lines was investigated. These aAA were not or only marginally mutagenic in wild type cells or in recombinant cells expressing CYP1A2 alone. If CYP1A2 was co-expressed with SULT forms of the 1A subfamily clear mutagenic effects occured in low concentrations of the aAA (0,3 &#181;M for 2-acetylaminofluorene and 3&prime;-methyl-4-dimethylaminoazobenzene; 0,1 &#181;M for 2-aminoanthracene; 10 &#181;M for 2,4-diaminotoluene). The strongest activation of 2-acetylaminofluorene and 3'-methyl-4-dimethylaminoazobenzene was mediated by SULTA2 and of 2-aminoanthracene and 2,4-diaminotoluene by SULT1A1. SULT1A1 and SULT1A2 are expressed polymorphically in humans. Differences in the activation potency of distinct alloenzymes for aAA may cause divergent individual susceptibilities for cancer induced by aAA. Briefly, the allelic variants of SULT1A2 showed substantial differences regarding their activation potencies for the investigated aAA. Only alloenzyme SULT1A2*1 was able to activate 2-acetylaminofluorene to a mutagen whereas 3&prime;-methyl-4-di-methylaminoazobenzene was activated by alloenzymes SULT1A2*1 and SULT1A2*2. The investigated alloenzymes of SULT1A1 showed equal activation potencies for aAA. In previous studies it had been shown that the SULT1C1 plays an important role in the activation of aAA in rats. However, the human SULT1C1 was not able to activate the investigated aAA in the study presented here. Such species differences might be important for the elucidation of divergent organotropisms of aAA in humans and animal models, since SULT are expressed with strong tissue specificities and the pattern of expression in humans and rats is severely different.…